Introdução
Hans
Christian Joachim Gram, foi um Bacteriologista dinamarquês que introduziu o uso
do microscópio na microbiologia. Existem
vários tipos de microscópios, quer os microscópios electrónicos de varrimento e
transmissão, quer os microscópios ópticos que podem ser de campo claro ou
escuro, fluorescência ou contraste de fase. No
caso do microscópio óptico de campo claro, o utilizado nesta experiência é um sistema de lentes que permite visualizar
o material em estudo com uma ampliação de cerca de 1000 vezes em relação ao
objecto real. A resolução deste tipo de microscópios é de 0, 25 micrómetros,
sendo que a do olho humano é de 0,1, sendo esta a capacidade de diferenciar
dois pontos muito próximos, o que irá influenciar a ampliação útil do
microscópio. Conseguimos ver o objecto em estudo através do contraste do mesmo
com um fundo claro, sendo utilizado para observar características morfológicas
grosseiras de tecidos células e bactérias. A coloração de Gram, assim chamada
por ter sido introduzida por Gram, baseia-se na diferenciação da capacidade de
retenção de um corante por parte de bactérias, e através da aplicação de dois
corantes com uma lavagem intermedia, conseguem distinguir-se claramente dois
grupos distintos de bactérias, sendo classificados em Gram positivas e Gram
negativas. Esta técnica é uma das principais utilizadas, pra separar grupos de
bactérias, sendo uma técnica inicial de rastreio, que permite eliminar
facilmente um grande grupo de bactérias.
Material
-
lâminas
-
ansa
-
pinça
para lâminas
-
marcador
-
pipeta
de Pasteur
-
bico
de bunsen
-
microscópio
Reagentes
-
Cristal de violeta
-
Soluto de Lugol
-
Álcool
-
Safranina
Método
Marcar
nas placas a zona onde será posta a colónia, e proceder a sua identificação em
numeração romana
Proceder à
montagem da primeira amostra partindo do meio liquido, agitando o meio liquido
Retirar um
pouco do meio de cultura com a pipeta de Pasteur e colocar na lâmina na área marcada
Secar a
lâmina lentamente no bico de bunsen
Proceder à
fixação pelo calor passando a lâmina 3x pela chama intensa de modo a matar
todas as bactérias
Colocar o cristal
de violeta e corar todas as bactérias, deixar atuar por um minuto
Aplicar
Soluto de Lugol que garante a fixação do corante, deixar atuar por um minuto
Aplicar o
álcool que vai retirar o corante das bactérias Gram negativas
Aplicar a
Safranina que irá corar apenas as bactérias que não possuem cristal de violeta
Proceder à
montagem da segunda amostra partindo do meio sólido, deitando uma gota do
liquido de suspensão na lâmina
Passar a
ansa pela chama e retirar uma colônia, a colocar no liquido
A partir
daqui proceder da mesma forma que para a amostra do meio liquido
Resultados
Em
ambas as amostras foi possível observar bactérias Gram positivas e Gram
negativas, conseguindo distinguir as cores rosada e violeta. Foi também possível vislumbrar a forma das
bactérias, pelo facto das mesmas estarem coradas. Sendo este o objectivo da
experiência, podemos dizer que os resultados da mesma foram os esperados.
Análise de Resultados
Existem
várias explicações avançadas para o facto de um tipo de bactérias manter a cor,
e o outro não, todas com lógica. Sabendo-se
que existem diferenças morfológicas entre as bactérias, uma das hipóteses que
se coloca é que devido a uma maior grossura da parede por arte de alguma
bactérias, estas retenham de forma mais
eficaz o corante. Outra das explicações consiste no facto do etanol causar a
impermeabilização da membrana de algumas bactérias, sendo que destruirá o
corante existente na parede de outras bactérias . Nesta
experiência são necessários alguns cuidados, nomeadamente, não pode ser
esquecida a desinfeção da ansa aquando do manuseamento do dos reagentes, os
tempos em que se submetem as amostras a chama deverão ser bem calculados, tal
como a distância à chama e a força da mesma, para que não se comprometa a
amostra, e devem ser ainda calculados os tempos de reação, quer os tempos de
ação dos corantes e do soluto de Lugol, quer do álcool que não pode atuar muito
tempo, sob o risco de destruir completamente o corante, mesmo nas bactérias
mais resistentes, nem pouco tempo, sob pena de não descorar nenhum dos tipos
das bactérias. O
segundo corante a utilizar deverá sempre ser mais claro que o primeiro, de modo
a que não se sobreponha, contaminando os resultados.
Bibliografia
-
Conhecimentos adquiridos na aula prática de microbiologia
alimentar I
-
PELCZAR, Michael J., Microbiologia – Conceitos e Aplicações, volume I, Edições Makron
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