A actividade experimental realizada na aula teve como objectivo executar e interpretar
os resultados e transformações metabólicas, estes ocorridos durante os testes realizados,
de forma a facilitar a identificação posterior de bactérias.
Foram apresentados variados métodos de identificação, no entanto só foram realizadas 3
experiências: a aglutinação (efectuada somente pelo docente), a catalase e a prova da
citocromo‐oxidase.
No primeiro teste foi possível identificar ao pormenor uma bactéria, a salmonela, devido
à utilização de um soro específico (soro anti‐salmonela), já os outros dois testes somente
foram realizados como forma de identificação visual de reações, uma vez que os inóculos
eram desconhecidos e o objectivo da experiência não era identificar espécies, mas sim
entender o conceito das provas bioquímicas.
Introdução Teórica
Há testes que permitem comprovar e verificar bioquimicamente certas espécies e as suas
características, uma vez que se baseiam nas respostas metabólicas que apresentam
consoante o meio. Denominam‐se provas bioquímicas, consistem em processos de
identificação e caracterização de microorganismos isolados através de transformações, a
nível químico, que podem ou não apresentar.
Estes testes são realizados de forma a reduzir trabalho, tempo e custo, como também é o
método mais exato de identificar propriedades fulcrais de um dado micróbio.
Cada microorganismo tem um metabolismo específico, que promove uma transformação
química específica, portanto há um número mínimo de propriedades que devem ser
identificadas para que sejam designados correctamente. Óbvio que quantos mais testes
forem realizados, maior é a probabilidade de um diagnóstico acertado.
Reacções que possam ser observadas como a presença de borbulhas ou mudança de cor
são métodos para estabelecer se um dado microorganismo tem ou não um dado
componente celular que lhe confere uma dada característica.
Os testes podem apresentar resultados positivos ou negativos, podendo também
demonstrar diferentes níveis ou intensidades (o que caracteriza a presença do
componente celular que se pretende testar).
Entre os testes apresentados, este relatório foca as experiências realizadas e as provas
correspondentes, no entanto apresentam‐se também os restantes métodos incluídos na
unidade curricular, uma vez que serão utilizados num futuro próximo:
Aglutinação (testes sorológicos): Este tipo de prova é utilizada muitas vezes no ramo
da medicina pois é uma técnica de detecção de antigenos. Estes antigenos, como que
chaves para uma fechadura, só se ligam a certos receptores específicos. A partir do
momento que conhecemos o soro ou o seu poder antigénico, é possível determinar e
identificar um dado microoganismo ou composto químico. É diversamente utilizado,
desde para a identificação de drogas, estádios de doença, selecção de doadores e
receptores de órgãos, avaliação da imunidade humana e eficiência de tratamentos.
Catalase: Detecção da enzima catalase, que é responsável pela transformação de
peróxido (tóxico para a célula) em água e oxigénio. Quando esta é uma componente da
bactéria em estudo, ocorre efeverscência, sendo o teste positivo devido à libertação de
oxigénio. Realizado para diferenciar staphylococcus (+) de streptococcus (‐). Para a
realização do teste é necessário colocar 2 a 3 gotas de água oxigenada numa lâmina e
colocar uma amostra de colónia na solução de forma a que se encontre dispersa nesta.
Após alguns instante é ou não possível verificar a formação de bolhas, que traduz a
libertação de oxigénio por parte da bactéria.
Prova da citocromooxidase:
Relaciona‐se com a presençade citocromos da cadeia
respiratória de alguns microorganismos. É utilizado um papel de filtro que contém o
reagente incolor tetrametil p‐fenileno de amina. O teste é positivo quando até um minuto
se desenvolver uma cor púrpura e negativa se não ocorrer alteração de cor ou
apresentar uma cor rosa pálida.
Prova da oxidação/fermentação: Consiste na utilização de um açúcar específico, uma
em condições aeróbias e outra em condições anaeróbias (utilização de parafina para
impedir o contacto com o oxigénio). É feita uma incubação até 24 horas, o teste é positivo
quando se verifica uma alteração de cor nos tubos. A conclusão é feita a partir da análise
da mudança consoante o tubo: se for no que tem parafina é porque a bactéria é
anaeróbia, se for na outra já é aeróbia, se for em ambas é anaeróbia ou aeróbia
facultativa.
Prova do Manitol (mobilidade): A utilização ou não do manitol comprova a capacidade
de mobilidade de um micróbio. É feita uma picada central num meio semi‐sólido num
tubo e introduz‐se o manitol de cor avermelhada. Se o manitol for utilizado, o meio passa
de vermelho a amarelo, tratando‐se de um microrganismo capaz de se mover, se não for
utilizado a cor permanece intacta o que indica que há ausência de locomoção por parte
da bactéria.
Teste de Klinger: Dois testes com base na caracterização das reacções metabólicas de
um dado microrganismo. Utiliza‐se diferentes açucares e observa‐se o comportamento
das bactérias consoante a presença no meio.
Produção de gases: Aparecimento de bolhas devido à acção da enzima formiato.
Produção de ácido sulfídrico: Aparecimento de precipitado negro devido à acção da
enzima tiossulfato redutase.
Prova do vermelho de Metilo: Teste que avalia a oxidação da glicose em substratos
ácidos. A experiência efectua‐se num meio de vermelho de metilo. É utilizado para
identificar valores ácidos relativamente baixos, uma vez que se o pH for 6, o teste é
negativo, pois não há concentração suficiente de iões de hidrogénio capazes de
apresentar uma cor avermelhada. Quando o teste é negativo o vermelho de metilo passa
a amarelo.
Prova de VogesProskauer:
Também é utilizado um meio vermelho de metilo, mas é
para identificar produtos finais não‐ácidos ou neutros. Esta identificação é feita através
da adição do reagente de Barrit’s, se houver o desenvolvimento de cor rosa o resultado é
positivo, se houver ausência de cor é negativo.
Prova do Indol: Determina a presença de triptofanase e a capacidade de uma bactéria
em converter triptofano em indol. Este teste serve como marcador bioquímico uma vez
que nem todos os microorganismos têm esta capacidade. Num meio que contenha
triptofano efectua‐se o crescimento de uma colónia, depois pesquisa‐se a presença de
indol ao adicionar o reagente de Kovac’s (amarelo) ao longo das paredes do tubo. Se o
indol estiver presente, o reagente produz um composto rosado. Se o amarelo de Kovac’s
for persistente significa que a reação é negativa e a capacidade de hidrolisar o triptofano
é nula.
Desaminação da Fenilalanina: A desaminase da fenilalanina produz ácidos orgânicos,
água e amónia. A presença desta enzima forma ácido fenilpirúvico, depois adiciona‐se
cloreto de ferro que, se reagir com este ácido forma‐se um composto verde, que é um
resultado positivo.
Prova da redução dos nitratos: Na ausência de oxigénio, microrganismos aeróbios ou
anaeróbios facultativos efectuam processos oxidativos, utilizam substâncias inorgânicas
como os nitratos ou sulfatos, transformando‐os em nitritos ou sulfitos de forma a obter
oxigénio como aceitador final de electrões de forma a obter energia. Através da detecção
de nitritos no meio é possível concluir se a bactéria em questão tem esta capacidade
enzimática. Adiciona‐se dois reagentes: ácido sulfanílico e α‐naftilamina. A presença de
nitritos promove a mudança de cor imediata para vermelho, se for negativo não há
nenhuma alteração visível. Por vezes, é possível a bactéria reduzir os nitritos a amónia
ou azoto, o que também representaria um resultado negativo, para verificar se de facto
ocorreu esta segunda transformação basta adicionar zinco em pó (dado que também
reduz nitratos a nitritos) se for possivel observar uma cor vermelha é porque os nitratos
não foram reduzidos (reacção negativa) se após a adição de zinco não se verificar nada e
porque os nitritos foram reduzidos (reacção positiva).
Prova da Urease: A urease é uma enzima hidrolítica que destrói a ligação entre o azoto e
o carbono da ureia, formando amónia, água e dióxido de carbono. Isto torna o meio
alcalino e, aquando a utilização de vermelho de fenol (indicador de pH) passa de amarelo
a rosa (reacção positiva).
Descarboxilase: Remoção do grupo carboxilo de aminoácidos por parte de bactérias
que crescem em meio líquido, principalmente quando é ácido e com ausência de
oxigénio.
ONPG: Teste geralmente efectuado em bactérias gram negativas que contem uma
enzima específica para a utilização da lactose (β‐galactosidase). Coloca‐se um
microrganismo inoculado num meio com lactose de forma a verificar se ha produção da
enzima em questão.
Coagulase: Enzima que coagula o plasma sanguíneo é utilizado para distinguir espécies
patogénicas de não patogénicas. Exº staphylococcus aureus. A formação de coágulos é
visível após 2, 6 ou 24 horas.
Sistema API (Analytical Profile Índex) 20 E: Utilizado para identificar enterobacteriae
e outros bacilos gram negativo. É um sistema de tubos que permite realizar 22 provas.
Tem um período de incubação entre 18 a 24 horas e a identificação do micróbio é feita
através da observação da mudança de cor. Determina‐se um código de 7 digitos que
permite a identificação da bactéria através da consulta no API 20 E Profile Índex Booklet
ou através de um sistema de computador.
Materiais, equipamentos e reagentes
• Ansa (ferro e plástico)
• Lâmina
• Bico de Bunsen
• Lamparina
• Colónias desconhecidas (3 em caixas de petri e 5 em tubos de ensaio)
• Solução de peróxido a 3% com M = 34,01 g/mol
• Filtros de teste de deteção de citocromo oxidase
• Contador de colónias (somente para utilização da lupa)
Procedimento
O primeiro teste efectuado, somente para observação por parte dos alunos, foi da
aglutinação. O objectivo era comprovar a identidade de um micróbio patogénico bastante
conhecido, a salmonela, através da adição de um soro anti‐salmonela. O que acontece é
que este soro contém antigénios específicos que se ligam apenas a esta bactéria
específica, provocando a formação de grumes. Primeiro esterilizou‐se a ansa com o
auxilio do bico de bunsen, passou‐se a ansa levemente na superfície do inoculo de forma
a não arrastar agar, colocou‐se previamente uma gota do soro numa lâmina e, com
movimentos circulares, misturou‐se o a amostra no soro (primeiro não se toca no soro e
depois arrasta‐se e mistura‐se na solução) e verificou‐se a formação de pequenos
aglomerados. Este soro é responsável pela inactivação da salmonela, quando em
contacto ocorre uma reação de seroaglutinação.
Os dois testes seguintes foram efectuados pelos alunos, a catalase e a prova da
citocromo‐oxidase.
O primeiro teste consistiu em colocar 3 gotas de peróxido numa lâmina, cada gota para
um inoculo diferente, cada um de carácter desconhecido. Realizou‐se o mesmo
procedimento como no teste da aglutinação, mas em vez que esperar para verificar
formação de grumes, o objectivo foi verificar ou não a formação de borbulhas. A primeira
cultura apresentava uma cor amarelada, a segunda já era mais transparente tal como a
terceira.
O terceiro e último teste, a prova da citocromo‐oxidase, utilizou‐se um papel de filtro que
já contem o reagente necessário à identificação da presença ou ausência de citocromos
como composto celular da bactéria. Foram realizados testes em 5 colónias diferentes (2
em tubos de ensaio e 3 em caixas de petri) na mesma tira de papel, inicialmente utilizouse
uma ansa de ferro previamente esterilizada no bico de bunsen, no final da experiência
trocou‐se esta ansa por uma de plástico.
Resultados
O primeiro teste, da aglutinação, deu positivo uma vez que o microrganismo a ser testado
era conhecido e tinha como objectivo demonstrar alterações físicas visíveis necessárias à
identificação e interpretação de resultados.
O segundo teste, com três culturas diferentes, também deram positivo, embora com
intensidades diferentes.
Verificou‐se que a segunda amostra demonstrou maior libertação de oxigénio que as
outras, a primeira continha borbulhas muito pequenas e a terceira tinha a menor
quantidade, muito dispersas e pouco visíveis.
No teste do citocromo oxidase os resultados deram todos positivos mas também de
intensidades diferentes (algumas com cor mais intensa que outras), foi necessário
substituir a ansa de ferro por uma de plástico uma vez que a primeira pode interferir
com os resultados e demonstrar um falso positivo. A fotografia tirada na aula tem uma
péssima qualidade, por isso não será demonstrada como comprovativo de resultados.
Discussão
Considerando o primeiro resultado, do teste da aglutinação, a formação de grumes
demorou algum tempo a visualizar. Foi então necessário recorrer à lupa do conta
colónias, mas ao fim de alguns minutos foi bastante visível esta transformação química.
Em relação ao segundo teste, o facto de cada colónia demonstrar uma quantidade de
borbulhas diferente pode ter a ver com a quantidade do microrganismo misturado ou a
eficácia da enzima catalase presente nas bactérias. Também pode ser devido à
concentração da solução de peróxido, provavelmente uma concentração mais alta
provocaria uma reação maior, no entanto não é o mais apropriado para este protocolo
dado que o objectivo também é avaliar a sensibilidade das bactérias consoante os meios.
O terceiro e último teste demonstrou resultados pouco satisfatórios uma vez que a
intensidade da cor púrpura variou bastante. A utilização de uma ansa de ferro pode ter
provocado um falso positivo, sendo que a última colónia analisada foi retirada com uma
ansa de plástico. Outra dificuldade que pode ter provocado os resultados insatisfatórios é
o facto de, aquando a passagem das bactérias para o papel, grande parte destas mantémse
na ansa, e é bastante difícil colocar uma dose razoável no papel para obter um
resultado específico.
Conclusão
Ao realizar esta actividade experimental foi possível verificar que há uma série de provas
necessárias e fulcrais à identificação microbiológica – provas bioquímicas. Consistem em
testes que carácter químico cujas funções é dar uma resposta positiva ou negativa face à
investigação de uma dada característica.
É um instrumento importante para o diagnóstico de doenças ou presença de agentes
patogénicos, sendo que no sector alimentar trata‐se de um método de controle de
qualidade de variados produtos. Este aspecto é muito importante visto que o consumidor
final não tem conhecimentos, muito menos controlo, sobre os diversos microrganismos e
riscos associados à sua ingestão.
O mundo microbiológico é realmente vasto e também específico, pela diversidade de
bactérias que existem e pelas inúmeras diferenças metabólicas entre elas que lhes
conferem características e funções tão distintas.
Bibliografia
Documento informativo sobre as diversas provas bioquímicas, consultado a
23/11/2012, disponível em:
http://www.google.pt/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&sqi=2&ved=
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http://plataforma.eshte.pt/moodle/mod/resource/view.php?id=14122
Imagem capa, consultado a 27/11/2012, disponível em:
http://dgratisfarmacia.blogspot.pt/2011/05/pop‐de‐bioquimica.html
Equipamentos, consultado a 27/11/2012, disponível em:
http://www.instrument.com.cn/show/literature/c17385.pdf
Testes sorológicos, consultado a 26/11/2012, disponível em:
http://www.famerp.br/projis/grp07/sorologia.html
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