SQHA:: Relatório de Técnicas de isolamento de colónias bacterianas

É do conhecimento geral que dentro do “mundo dos humanos” existe outro mundo, o mundo bacteriano que nos cerca e é imprescindível investiga-lo. Para isso temos de repartir esse mundo de forma a distinguir os seus constituintes e, de seguida, isolá-los e semeá-los (bactérias) para que à medida que se vão desenvolvendo possamos estudar os seus comportamentos. Para isola-los e semear existem diversas técnicas, designadas de meios de cultura. Estes meios de cultura podem apresentar-se em diversos estados físicos[1]: líquidos, semi-sólidos ou sólidos. A escolha do estado físico prende-se com a relação das pesquisas em causa. Estes meios de cultura fornecem nutrientes indispensáveis aos microrganismos, que caso contrário impossivelmente permitiria o seu desenvolvimento. Para a realização dos meios de cultura, a matéria mais utilizada é o agar, pois contém propriedades essenciais para um equilibrado desenvolvimento microbiano. Entre elas temos o facto de ser estável a altas ou baixas temperaturas, sendo que a altas temperaturas se encontra no estado líquido e a baixas no estado sólido, temos o facto de não ser facilmente degradado pelos microrganismos, sendo que apenas alguns conseguem fazê-lo.

O presente relatório que consta de duas actividades diferentes: numa primeira parte a apresentação teórica acerca dos meios de cultura e propagação/sementeiras e na segunda a aplicação do leccionado na prática. Demonstra assim as diferentes técnicas de propagação de microrganismos que compreendem o esgotamento, o espalhamento, a picada central e a incorporação. Técnicas que consistem em recolher um pouco de uma colónia e isolá-la ao ser semeada num meio em que possa desenvolver-se, isto é, um meio de cultura[2]. A partir desse desenvolvimento iremos aperceber-mo- nos de que tipo de microrganismo se trata e o que se pode fazer perante o próprio.

2-   PARTE EXPERIMENTAL – Material e Métodos

2.1.    Material:

Ø  Placas de Petri com meio de cultura PCA

Ø  Tubos de Ensaio

Ø  Suporte para tubos de ensaio

Ø  Meios de Cultura sólidos e líquidos

Ø  Estilete

Ø  Ansa de metal ou descartável

Ø  Bico de Busen

Ø  Micropipeta ou micrométrica

Ø  Semeador descartável

Ø  Caixa de Petri esterilizada

Ø  Meio de cultura em Agar (estado líquido)

Ø  Algodão cardado

Ø  Caneta de acetato

2.2.    Métodos:

ª  Inicialmente prepara-se uma diluição de 1:10, ou seja, 1mL do tubo de ensaio com a cultura para o tubo de ensaio com água peptonada e tamponada[3]. Apenas o método de incorporação é preparado tendo como inoculação este meio de cultura diluído.

Esgotamento:

1.          Escolher a colónia.

2.          Marcar o fundo da caixa de petri com a caneta de acetato contendo o nome, turno, grupo, técnica utilizada e a cultura bacteriana utilizada.

3.          Em seguida passar a ansa pela chama do bico de bunsen.

4.          Depois deixar a ansa arrefecer na tampa e retirar o inóculo e efectuar o processo de esgotamento (ilustração 1).

5.          Colocar na estufa para que as culturas se poção multiplicar.

Espalhamento:

1.          Escolher a colónia.

2.          Marcar o fundo da caixa de petri com a caneta de acetato contendo o nome, turno, grupo, técnica utilizada e com a cultura bacteriana utilizada.

3.          Em segundo agitar a cultura de meio liquido no vortex, retirar o rolhão de algodão e passar à chama três vezes.

4.          Em seguida com ajuda da pipeta retirar 0,1ml de inoculo da cultura líquida, passar novamente com o tubo de ensaio três vezes a chama e tapar.

5.          Depois colocar o inóculo na placa de petri e com ajuda do semeador, espalhar muito bem o inóculo mexendo a placa de petri no sentido dos ponteiros do relógio e a vareta no sentido oposto para que o inóculo fique bem espalhado para se obter colónias isoladas. 

6.          Colocar na estufa para que as culturas poção se multiplicar. 

Picada Central:

1.          Marcar o tubo de ensaio com a caneta de acetato contendo o nome, turno, grupo, técnica utilizada e com a cultura bacteriana utilizada.

2.          Escolher a colónia.

3.          Passar o estilete pela chama até ficar incandescente, arrefecer na tampa de caixa de petri e retirar a colónia escolhida.

4.          Retirar o rolhão de algodão do tubo de ensaio passar três vezes à chama e com o estilete perfurar a cultura na zona mais grossa e ir espalhando pela superfície da cultura. Passar novamente a chama três vezes e tapar com o algodão.

5.          Colocar novamente o estilete na chama até ficar incandescente e coloca-lo no suporte. 

6.          Por o tubo de ensaio na estufa para que a poção se possa dividir.

Incorporação:

1.          Marcar o fundo da caixa de petri com a caneta de acetato contendo o nome, turno, grupo, técnica utilizada e com a cultura bacteriana utilizada.

2.          Agitar a cultura de meio liquido no vortex, retirar o rolhão de algodão e passar a chama três vezes, em seguida com ajuda da pipeta retirar 1ml de inoculo da cultura líquida, passar novamente com o tubo de ensaio três vezes a chama e tapar.

3.          Depois colocar o inóculo na caixa de petri e em seguida colocar o meio de cultura que se encontra no estado líquido (deixar arrefecer um pouco, até ficar morno).

4.          Colocar a tampa e agitar 8 vezes no sentido dos ponteiros do relógio e 8 veze em oposto, 4 vezes e 4 vezes no sentido oposto, 2 vezes e 2 vezes no sentido oposto e 1 vez e 1 vezes no sentido oposto (sentido horizontal). 

5.          Fazer o mesmo processo, mas agora na vertical.

6.          Deixar solidificar e colocar na estufa para que a cultura possa crescer.

3-   RESULTADOS

Método de isolamento por Esgotamento:

·         O objectivo consistia em esgotar a superfície da placa de petri e, após a incubação detectar colonias isoladas e se existiriam culturas puras (um tipo de bactérias) ou mistas (vários tipos de bactérias).

·         Constatou-se então a existência de uma cultura mista devido à existência de colonias isoladas.

Método de isolamento por Espalhamento:

·         O objectivo consistia em espalhar bem as colónias para uma melhor contagem.

·         Constatou-se que o meio de cultura líquido estava muitíssimo concentrado, pois observou-se colónias de bactérias por toda a superfície.

Método de isolamento por picada central:

·         O objectivo consistia em observar a reacção das bactérias ao ar e metabolismo (aeróbio, anaeróbio, anaeróbio facultativo ou microaerófilos).

·         Constatou-se que a bactéria se desenvolveu tanto dentro do agar, onde não há presença de O₂, como à superfície do agar, onde há interacções com o O₂. 

Método de isolamento por incorporação:

·         O objectivo consistia em espalhar bem as colónias para uma melhor contagem, bem como observação da sua reacção ao ar.

·         Observou-se a existência de bactérias espalhadas por toda a superfície da caixa de petri, bem com uma grande concentração.

4-   DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

No isolamento por esgotamento, no nosso grupo, verificou-se o objectivo pretendido. Observar-se o isolamento de colónias. Já o espalhamento não satisfez os requisitos, porque a meu ver as colonias estão todas aglomeradas, ainda que algumas estejam isoladas e fáceis de contar. Na picada central o objectivo foi preenchido, visto que observou-se que a bactéria desenvolveu-se tanto dentro do agar, sem presença de O₂, como à superfície com presença do O₂, ou seja, trata-se de uma bactéria aeróbia facultativa.

Concluo assim que as técnicas utilizadas em laboratório não “fáceis”, talvez devido à falta de prática e de à vontade. Mas tratam-se, de técnicas que nos permitem isolar as colónias semeadas e realizar uma melhor contagem das mesmas, dando-nos a percepção do seu grau de desenvolvimento e noutras as suas definições como, por exemplo, se, se desenvolvem com a presença ou não de oxigénio (aeróbias e anaeróbias). No entanto para isso, é necessário que o processo seja executado correctamente. Até porque na prática realizada, observaram-se em algumas caixas de petri certas falhas, como a título de exemplo: o Agar rasgado impossibilitando o desenvolvimento da cultura ou no esgotamento a ausência de colonias isoladas.

Apronto também que para compreender o mundo microbiano que nos rodeia, este tem de ser muito bem estudado. Ora a técnica de isolamento torna-se bastante útil ao permitir um melhor controlo sobre o mesmo, bem como ajuda num melhor combate à diminuição de riscos patogénicos.

Referencias:

Anon., s.d. Prática 2: Cultura de Microrganismos. [Online]
Available at: http://www3.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat2.pdf
[Acedido em 15 11 2012].

Nicésio, R. G., 2007. Meios de Cultura. [Online]
Available at: http://www.biomedicinabrasil.com/search/label/Microbiologia

Ambiental, D. E., s.d. Meios de Cultura. [Online]
Available at: http://professor.ucg.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/5583/material/Meios%20de%20Cultura%20aula%20pr%C3%A1tica.pdf
[Acedido em 22 11 2012].

Wikipédia, 2012. Meio de cultura. [Online]
Available at: http://pt.wikipedia.org/wiki/Meio_de_cultura
[Acedido em 22 11 2012].